细胞凋亡是生命过程中重要的自我调节机制，通常伴随着显著的细胞形态变化。例如，在细胞凋亡的早期阶段，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻转到细胞膜表面；而在凋亡的中后期，细胞膜的通透性增强，使得一些大分子化合物如碘化丙啶（PI）可以自由扩散进入细胞，从而使细胞核显现红色荧光。

Annexin V/PI检测法原理

金年会金字招牌诚信至上 的Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能够与PS高亲和力地特异性结合。它不能穿透完整的细胞膜，因此早期凋亡细胞的膜保持完整，不会被PI染色。然而，在细胞凋亡的中晚期以及死亡细胞中，PI可以穿透细胞膜，从而使细胞核被染成红色。因此，将Annexin V与PI结合使用，可以有效地区分早期凋亡细胞与其他细胞。

Annexin V/PI凋亡检测推荐

产品名称：流式凋亡检测试剂盒
货号：AC12L033
规格：100T

操作步骤

对照管的设置

1. 空白管：不加染料的诱导凋亡细胞，用于电压调节；
2. 单染管：分别添加PI和荧光标记的Annexin V用于补偿调节；
3. 实验管：将所有荧光染料添加到诱导凋亡的细胞中；
4. 阴性管：向正常培养细胞中加入染料，以验证细胞状态并排除假阳性。

悬浮细胞收集染色

1. 完成细胞凋亡刺激后，离心5分钟，弃上清，使用PBS轻轻重悬细胞并计数；
2. 取1~5×10⁵重悬细胞，离心5分钟，加入500µl结合液后轻轻重悬；
3. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀，再加入5µl碘化丙啶，混匀；
4. 室温避光孵育10分钟（可使用铝箔避光）；
5. 随即进行流式细胞仪检测，其中Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

贴壁细胞收集染色

1. 把细胞培养液吸出至合适离心管，使用PBS洗涤贴壁细胞一次，用胰酶消化细胞（建议不使用含EDTA的消化液）；
2. 消化后的细胞，按照悬浮细胞的操作步骤继续处理。

上机检测

染色孵育完成后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。

Annexin V/PI流式结果分析

左上象限（Annexin V-/PI+）：细胞碎片、机械损伤细胞或其他死亡细胞，细胞数量越多则实验可信度越低；
左下象限（Annexin V-/PI-）：正常活细胞；
右上象限（Annexin V+/PI+）：晚期凋亡细胞或坏死细胞，其细胞膜损伤使得DNA被PI染成红色荧光；
右下象限（Annexin V+/PI-）：早期凋亡细胞，此阶段PI无法染色，不会产生红色荧光信号。

注意事项

• 在检测贴壁细胞时，若无法控制消化时间，建议使用Accutase细胞消化液，减少对细胞的损伤，并不改变PS的分布。
• 选择Annexin V的荧光染料时，需考虑细胞的自发荧光，特别是长期培养或经药物处理的细胞，需注意细胞代谢物和药物本身的荧光可能干扰检测结果。一般推荐使用Annexin V-APC，以避免干扰。
• 染色后应尽快检测，禁止固定，检测管可放置于冰上以减少环境影响。
• 在统计凋亡时，通常仅统计早期凋亡情况，因为其结果更具意义，但文献中也存在对总凋亡比例（早期与晚期之和）的统计，单纯统计晚期凋亡的意义相对较小。

通过以上步骤，利用金年会金字招牌诚信至上的技术方案可以有效检测和分析细胞凋亡的过程，为相关生物医学研究提供重要依据。